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BEL-7404人肝癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作步驟

細(xì)胞傳代與擴(kuò)增

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時即可傳代。棄去舊培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS輕柔洗滌2次，加入0.25%（含0.02% EDTA）1mL，37℃消化1-2分鐘。鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓后，立即加入2mL培養(yǎng)基終止消化，輕柔吹打形成單細(xì)胞懸液。1000rpm離心5分鐘，棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸后按1:2~1:3比例分至新培養(yǎng)瓶，補(bǔ)充培養(yǎng)基至3mL/瓶，標(biāo)記好代次與日期。

凍存與復(fù)蘇

凍存液配制：培養(yǎng)基與DMSO按9:1比例混合，4℃預(yù)冷。取對數(shù)生長期細(xì)胞，按傳代方法消化后計數(shù)，調(diào)整密度至5×10?/mL，與凍存液1:1混合分裝至凍存管，標(biāo)注細(xì)胞名稱、代次、日期。采用梯度降溫法：4℃ 30min→-20℃ 2h→-80℃過夜，最后轉(zhuǎn)入液氮長期保存。復(fù)蘇時快速將凍存管置入37℃水浴，融化后轉(zhuǎn)移至15mL離心管，加5mL預(yù)溫培養(yǎng)基稀釋，離心去上清，重懸后接種至培養(yǎng)瓶。

實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制

（1）定期檢測支原體污染（每2月1次），推薦使用PCR法；

（2）傳代時保留細(xì)胞形態(tài)照片，異常形態(tài)需排查污染或代謝問題；

（3）關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行活力檢測（臺盼藍(lán)染色法活細(xì)胞率應(yīng)>95%）；

（4）建立細(xì)胞生長曲線，記錄群體倍增時間（PDT），BEL-7404正常PDT為24±2小時。

注意事項

（1）所有操作需在超凈臺內(nèi)完成，避免交叉污染；

（2）消化時間根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)動態(tài)調(diào)整，過度消化會導(dǎo)致細(xì)胞損傷；

（3）凍存細(xì)胞復(fù)蘇后換液需保留50%原培養(yǎng)基；

（4）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)需記錄培養(yǎng)基批號、血清來源等關(guān)鍵參數(shù)。

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