與質(zhì)譜(mass spectrometry)相關(guān)的技術(shù).
質(zhì)譜已成為連接蛋白質(zhì)與基因的重要技術(shù)，開啟了大規(guī)模自動化的蛋白質(zhì)鑒定之門. 用來分析蛋白質(zhì)或多肽的質(zhì)譜有兩個主要的部分，1)樣品入機的離子源，2)測量被介入離子的分子量的裝置. 首先是基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)為一脈沖式的離子化技術(shù). 它從固相標本中產(chǎn)生離子，并在飛行管中測其分子量. 其次是電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)，是一連續(xù)離子化的方法，從液相中產(chǎn)生離子,聯(lián)合四極質(zhì)譜或在飛行時間檢測器中測其分子量. 近年來，質(zhì)譜的裝置和技術(shù)有了長足的進展.ELISA試劑盒
在MALDI-TOF中，zui重要的進步是離子反射器(ion reflectron)和延遲提取(delayed ion extraction)，可達相當?shù)姆肿恿? 在ESI-MS中，納米級電霧源(nano-electrospray source)的出現(xiàn)使得微升級的樣品在30～40 min內(nèi)分析成為可能. 將反相液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜(tandem MS)聯(lián)用，可在數(shù)十個picomole的水平檢測；若利用毛細管色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，則可在低picomole到高femtomole水平檢測；當利用毛細管電泳與串聯(lián)質(zhì)譜連用時，可在小于femtomole的水平檢測. 甚至可在attomole水平進行. 目前多為酶解、液相色譜分離、串聯(lián)質(zhì)譜及計算機算法的聯(lián)合應(yīng)用鑒定蛋白質(zhì). 下面以肽質(zhì)指紋術(shù)和肽片段的測序來說明怎樣通過質(zhì)譜來鑒定蛋白質(zhì).
1)肽質(zhì)指紋術(shù)(peptide mass fingerprint, PMF)是由Henzel等人于1993年提出. 用酶(zui常用的是)對由2-DE分離的蛋白在膠上或在膜上于或賴氨酸的C-末端處進行斷裂，斷裂所產(chǎn)生的的分子量通過質(zhì)譜來測量 (MALDI-TOF-MS，或為ESI-MS)，這一技術(shù)能夠完成的肽質(zhì)量可到0.1個分子量單位. 所有的肽質(zhì)量zui后與數(shù)據(jù)庫中理論肽質(zhì)量相配比(理論肽是由實驗所用的酶來“斷裂”蛋白所產(chǎn)生的). 配比的結(jié)果是按照數(shù)據(jù)庫中肽片段與未知蛋白共有的肽片段數(shù)目作一排行榜，“*”肽片段可能代表一個未知蛋白.若冠亞軍之間的肽片段存在較大差異，且這個蛋白可與實驗所示的肽片段覆蓋良好，則說明正確鑒定的可能性較大.ELISA試劑盒
2)肽片段(peptide fragment)的部分測序. 肽質(zhì)指紋術(shù)對其自身而言，不能揭示所衍生的肽片段或蛋白質(zhì). 為進一步鑒定蛋白質(zhì)，出現(xiàn)了一系列的質(zhì)譜方法用來描述肽片段. 用酶或化學(xué)方法從N-或C-末端按順序除去氨基酸，形成梯形肽片段(ladder peptide). 首先以一種可控制的化學(xué)模式從N-末端降解，可產(chǎn)生大小不同的一系列的梯形肽片段，所得一定數(shù)目的肽質(zhì)量由MALDI-TOF-MS測量. 另一種方法涉及羧基肽酶的應(yīng)用，從C-末端除去不同數(shù)目的氨基酸形成肽片段.
化學(xué)法和酶法可產(chǎn)生相對較長的序列，其分子量至以區(qū)別賴氨酸(128.09)和(128.06). 或者，在質(zhì)譜儀內(nèi)應(yīng)用源后衰變(post-source decay, PSD)和碰撞誘導(dǎo)解離(collision-induced dissociation, CID)，目的是產(chǎn)生包含有僅異于一個氨基酸殘基質(zhì)量的一系列肽峰的質(zhì)譜. 因此，允許推斷肽片段序列. 肽片段PSD的分析在MALDI反應(yīng)器上能產(chǎn)生部分序列信息. 首先進行肽質(zhì)指紋鑒定. 之后，一個有意義的肽片段在質(zhì)譜儀被選作“母離子”，在飛行至離子反應(yīng)器的過程中降解為“子離子”.
在反應(yīng)器中，用逐漸降低的電壓可測量至檢測器的不同大小的片段. 但經(jīng)常產(chǎn)生不*的片段. 現(xiàn)在用肽片段來測序的方法始于70年代末的CID，可以一個三聯(lián)四極質(zhì)譜ESI-MS或MALDI-TOF-MS聯(lián)合碰撞器內(nèi)來完成. 在ESI-MS中，由電霧源產(chǎn)生的肽離子在質(zhì)譜儀的*個四極質(zhì)譜中測量，有意義的肽片段被送至第二個四極質(zhì)譜中，惰性氣體轟擊使其成為碎片，所得產(chǎn)物在第三個四極質(zhì)譜中測量. 與MALDI-PSD相比，CID穩(wěn)定、強健、普遍，肽離子片段基本沿著酰胺鍵的主架被轟擊產(chǎn)生梯形序列. 連續(xù)的片段間差異決定此序列在那一點的氨基酸的質(zhì)量. 由此，序列可被推測. 由CID圖譜還可獲得的幾個序列的殘基，叫做“肽序列標簽”. 這樣，聯(lián)合肽片段母離子的分子量和肽片段距N-、C端的距離將足以鑒定一個蛋白質(zhì).ELISA試劑盒
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