檢測ELISA夾心法定量蛋白方法
測定前提的優(yōu)化用棋盤測定法測定5ng/ml的rhGM-CSF/IL-3，表明hGM-CSFMcAb的濃度為10μg/ml，rhIL-3PcAb的稀釋度為1:100。但目前尚無一簡便有效的檢測方法對rhGM-CSF/IL-3進行定量檢測。100μl可以產(chǎn)生足夠陡的劑量反應(yīng)曲線，且本底低，是反應(yīng)體積。為了進一步研究其在體內(nèi)的藥效以及藥代動力，必需對其進行定量測定。綜上所述，本試驗建立的ELISA夾心法檢測速度快、重復(fù)性好、敏捷度高、特異性好，可對樣品濃度低至50pg/ml進行定量測定，幾乎不受其它生物活性物質(zhì)及血清成分的干擾，是對rhGM-CSF/IL-3進行有效檢測的好方法。
大腸桿菌表達的重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子/白細胞介素-3（rhGM-CSF/IL-3）融合蛋白進行了中試純化研究，進一步的研究表明rhGM-CSF/IL-3體外能促造血祖細胞的生長發(fā)育，具有較好的開發(fā)應(yīng)用遠景。基于rhGM-CSF/IL-3的免疫特性，本文建立了ELISA夾心法定量檢測rhGM-CSF/IL-3。ELISA夾心法測定rhGM-CSF/IL-3融合蛋白，用250mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS pH8.0）按適當比例稀釋的rhGM-CSF McAb100μl包被微孔板，20℃16h，將A液（0.1%Tween-20的PBS）洗板5次，加200μl1%BSA-PBS溶液206h，A液洗板，甩干，-20℃保留備用。當rhGM-CSF/IL-3濃度在0.49～6.25ng/ml時呈線性關(guān)系，回歸系數(shù)為r=0.995，建立的方法與各種血液組份和細胞因子無交叉反應(yīng)，敏捷度49pg/ml，批內(nèi)變異系數(shù)為5.96%，批間變異系數(shù)為7.08%。使用時解凍，每孔加樣本100μl，4℃16h;A液洗板5次，加B液（0.1%Tweem-20，0.1%BSA in50mmol/L PBS，pH7.3）適當稀釋的rhIL-3PcAb100μl1h;A液洗板5次，加100μl HRP-羊抗兔IgG，37℃1h;A液洗板，加100μl OPD顯色液（1mg/ml鄰苯二胺，0.012%H 2 O 2 ，100mmol/L檸檬酸-磷酸緩沖液，pH5.0），30min后用2mol/L H 2 SO 4 100μl終止反應(yīng)，用酶標儀檢測OD 490nm 值。
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