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產(chǎn)品僅供研究使用，不適用于人類或臨床診斷
商品屬性：

產(chǎn)品英文名稱：Human SCF Protein, His tag (Animal-Free)

產(chǎn)品中文名稱：重組人干細(xì)胞因子，His-標(biāo)簽無動(dòng)物源SCF

規(guī)格：5 μg/20 μg/100 μg/1 mg

貨號(hào)：EY-01X8748
用途：僅供科研研究實(shí)驗(yàn)

特點(diǎn)&優(yōu)勢(shì):

表達(dá)宿主:大腸桿菌

種屬:人

序列:氨基酸序列來源于：人SCF (Thr25-Ala189) (P21583)的氨基酸序列，在C端帶有6×His標(biāo)簽。

活性:通過其誘導(dǎo) TF-1 細(xì)胞增殖的能力來衡量。這種效應(yīng)的 ED??小于 5 ng/mL。重組人 SCF 的比活力大于 5 x 10? IU/mg。

蛋白長(zhǎng)度：該蛋白質(zhì)的計(jì)算分子量為 19.4 kDa。在還原條件下，蛋白質(zhì)遷移為 21 kDa（SDS-PAGE 分析）。

純度:> 98 % ，使用SDS-PAGE檢測(cè)

通過LAL法測(cè)定，每微克蛋白里內(nèi)毒素動(dòng)?動(dòng)

背景

干細(xì)胞因子（SCF）是一種含有 166 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，單體分子量約為 18.5 kDa。SCF 是酪激酶受體 c-kit 的配體，c-kit 可調(diào)節(jié)其他生長(zhǎng)因子，如粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）和白細(xì)胞介素-3，從而刺激造血干細(xì)胞的增殖和分化。成纖維細(xì)胞、平滑肌、內(nèi)皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞和骨髓巨噬細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞都能產(chǎn)生 SCF。

本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn):

 1.操作簡(jiǎn)便、快捷?？芍苯蛹尤氲綑z測(cè)平板。在96-孔板中檢測(cè)時(shí),無需洗滌或收獲細(xì)胞,免去溶解步驟。

2. 無放射性。不需要配制液閃混合物,也不需要處理廢棄物。

3. 與MTT相比,使用更安全。不需要使用揮發(fā)性的有機(jī)溶劑來溶解甲臜產(chǎn)物。

4. 操作靈活,與MTT不同,平板讀數(shù)后可放回溫箱繼續(xù)孵育,使顏色進(jìn)一步生成。

操作步驟：

(一)獲得目的基因

1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板,按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)),PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

(二)構(gòu)建重組表達(dá)載體

1、載體酶切:將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點(diǎn))進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

(三)  獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種

1、 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,根據(jù)重組載體的標(biāo)志(抗Amp或藍(lán)白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質(zhì)粒,雙酶切初步鑒定。

2、 測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆,重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。

3、 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。

(四)誘導(dǎo)表達(dá)

1、挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養(yǎng)。

2、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中, 37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr)。

3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組,余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實(shí)驗(yàn)組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。

4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸,混勻, 70℃10min。

5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。

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